利用重組菌表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白產(chǎn)物已經(jīng)成功走向商業(yè)化的道路。近年來(lái)，作為真核細(xì)胞的酵母表達(dá)系統(tǒng)，是繼大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)后最為流行的一種表達(dá)系統(tǒng)。相比于哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有著更高的效益。目前，甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母 (Pichia pastoris)是一種較為普遍的酵母表達(dá)系統(tǒng)，它的兩個(gè)基因 AOX1 和 AOX2 都可以編碼醇氧化酶（AOX），利用甲醇誘導(dǎo)可以啟動(dòng) AOX1基因的信號(hào)轉(zhuǎn)錄和翻譯。畢赤酵母最重要的特點(diǎn)是可以利用甲醇作為唯一碳源，將嵌入 AOX1 的外源蛋白基因表達(dá)出來(lái)，根據(jù)利用甲醇的能力，可以將細(xì)胞分為甲醇利用快型菌(Methanol utilization plus, Mut+，AOX1 與 AOX2 基因完好，可快速利用甲醇，其代表為 GS115 菌株)，甲醇慢速利用型菌(Methanol utilization slow, Muts，利用甲醇的 AOX1基因遭到破壞，AOX2 基因完好，因此甲醇利用能力下降，易出現(xiàn)甲醇中毒現(xiàn)象，其代表為 KM71 菌株)，和非甲醇依賴型菌 (Methanol utilization minus , Mut-，不能表達(dá)醇氧化酶，甲醇不作為碳源只作為誘導(dǎo)劑少量添加)。
畢赤酵母生產(chǎn)外源蛋白時(shí)，由于外源基因被整合在 AOX1 啟動(dòng)子上，因此，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：AOX1 啟動(dòng)子有強(qiáng)啟動(dòng)性和強(qiáng)誘導(dǎo)性；分泌的糖蛋白的糖基化位點(diǎn)與哺乳類(lèi)細(xì)胞相同，具有可進(jìn)行磷酸化、脂酞化和蛋白折疊，形成二硫鍵等典型的真核生物細(xì)胞翻譯后的修飾功能，因此免疫原性較低，分泌的動(dòng)物和人源蛋白臨床應(yīng)用更佳；表達(dá)效率高，一般情況下所分泌的外源蛋白占總蛋白的比例都超過(guò) 30%；外源基因遺傳穩(wěn)定；可高密度發(fā)酵，生產(chǎn)放大比較簡(jiǎn)單。因此，該表達(dá)系統(tǒng)在醫(yī)藥蛋白或抗體藥物、食品、動(dòng)物飼料添加劑生產(chǎn)上都有廣泛的應(yīng)用。
然而畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過(guò)程存在著一些不利于生產(chǎn)的特征：發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程氧耗大、能耗大，操作成本高；蛋白表達(dá)過(guò)程有強(qiáng)烈的時(shí)變特征，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)不易，發(fā)酵周期長(zhǎng)；細(xì)胞容易衰亡、代謝活性難以長(zhǎng)期維持，蛋白表達(dá)難以持續(xù)積累。因此需要進(jìn)一步探尋可提高發(fā)酵性能的策略和手段。
利用重組畢赤酵母生產(chǎn)外源藥物蛋白分成兩個(gè)階段：細(xì)胞生長(zhǎng)階段和甲醇誘導(dǎo)表達(dá)蛋白階段。在這兩個(gè)階段，菌體使用的碳源類(lèi)型不同。細(xì)胞生長(zhǎng)階段，重組畢赤酵母生長(zhǎng)情況類(lèi)似于其他酵母，該階段控制策略的主要目標(biāo)就是提高固定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的菌體濃度，為實(shí)施后續(xù)的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)打下基礎(chǔ)。該階段還可再細(xì)分為甘油分批和流加培養(yǎng)兩個(gè)子階段，主要目的是為了防止高濃度甘油對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，在生長(zhǎng)階段后期進(jìn)行甘油限制性流加。與外源蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量直接相關(guān)的是第二階段，該階段隨著誘導(dǎo)劑甲醇的加入，AOX 啟動(dòng)子被激活，隨之翻譯和轉(zhuǎn)錄嵌入在 AOX 基因上的外源蛋白。
甲醇進(jìn)入到畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶體后，在醇氧化酶（AOX）的催化作用下與 O2發(fā)生反應(yīng)，生成甲醛（HCHO）。一部分甲醛離開(kāi)過(guò)氧化物酶體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶作用下，最終氧化生成 CO2。此時(shí) 1 mol 甲醇完全氧化可以生成2 mol 的還原型輔酶 NADH 和 1 molCO2。另外一部分甲醛則在過(guò)氧化酶體內(nèi)的二羥基丙酮合成酶（DHAS）催化下與 5-磷酸木酮糖反應(yīng)，生成二羥基丙酮（DHA）和 3-磷酸甘油醛（GAP）。DHA 和 GAP 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，分別在二羥基丙酮激酶、1,6-二磷酸果糖醛縮酶和 1,6-二磷酸果糖磷酸酶的作用下，或進(jìn)入到戊糖途徑 HMP，或經(jīng)糖酵解途徑EMP 轉(zhuǎn)變?yōu)楸岷笤龠M(jìn)入到 TCA 循環(huán)。上述過(guò)程還伴隨有大量能量物質(zhì)的生成，可為菌體生長(zhǎng)、維持代謝和蛋白合成提供所需的前體物質(zhì)和能量物質(zhì)。
關(guān)于細(xì)胞利用甲醇的代謝分配比問(wèn)題，主要存在著兩種看法。Veenhuis等認(rèn)為，細(xì)胞利用大部分甲醇異化供能，少部分甲醇則進(jìn)入 TCA 循環(huán)，為合成目標(biāo)蛋白提供所需的前體物質(zhì)。這種觀點(diǎn)被許多學(xué)者廣泛接受和認(rèn)可。同時(shí)，也有一些學(xué)者如 Sibirny等認(rèn)為，甲醇異化代謝途徑的主要作用只是保護(hù)細(xì)胞不因大量甲醇的殘留而中毒，絕大部分甲醇進(jìn)入到了 TCA 循環(huán)的供能和蛋白合成途徑。但是，文獻(xiàn)并沒(méi)有闡述主要產(chǎn)能途徑是否受外界環(huán)境的影響。
探討甲醇型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的多種表達(dá)策略以及效果一直是國(guó)內(nèi)外論文研究的重點(diǎn)。除了對(duì)酵母菌自身進(jìn)行分子改造，發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化與控制也是有效實(shí)施表達(dá)策略、提高發(fā)酵性能的重要手段。發(fā)酵控制策略包括但不局限于：1）通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立細(xì)胞生長(zhǎng)模型或甲醇消耗模型，構(gòu)建流加控制系統(tǒng)；2）開(kāi)發(fā)或改善各類(lèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵表觀參數(shù)的設(shè)備，如研發(fā)更精確的甲醇在線檢測(cè)器等；3）使用共混流加誘導(dǎo)等方法改善細(xì)胞對(duì)甲醇的適應(yīng)能力。由于甲醇濃度、pH 最佳控制水平、低溫誘導(dǎo)的作用、以及非限制性碳源與甲醇的共混流加誘導(dǎo)等因素對(duì)不同菌種和目標(biāo)產(chǎn)物具有特異性，該領(lǐng)域的研究和報(bào)道較為集中。
課題組前期研究工作表明降低誘導(dǎo)溫度可以顯著提高目標(biāo)蛋白 pIFN-α 在畢赤酵母中的產(chǎn)量和抗病毒活性。在 Dragosis 等文中,通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為培養(yǎng)基時(shí),TCA 循環(huán)在低溫下處于上調(diào)水平，但文獻(xiàn)并未闡述這一發(fā)現(xiàn)對(duì)蛋白合成能量供應(yīng)的正面作用。而另一種畢赤酵母發(fā)酵優(yōu)化策略—誘導(dǎo)期混加山梨醇在規(guī)模化生產(chǎn)中具有更易于操作的優(yōu)勢(shì)。 Celik E 等人指出，誘導(dǎo)期山梨醇的添加可以起到多重作用：縮短細(xì)胞對(duì)甲醇誘導(dǎo)環(huán)境的適應(yīng)時(shí)間，降低細(xì)胞死亡率，進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度，消除乳酸積累和提高氧的利用能力等。汪志浩等人在研究中發(fā)現(xiàn)，以山梨醇作為輔助碳源，混合甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)優(yōu)于其他碳源的混合誘導(dǎo)。因此，甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)的方法也被廣泛采用。
