上海農(nóng)科院畜牧所成功地在一株甲醇利用慢型 (methanol utilization slow,MutS)畢赤酵母載體上克隆表達(dá)了 pIFN-α，搖瓶條件下的最高抗病毒活性達(dá)到 2.1×104IU/mL。筆者所在課題組將智能型模式識(shí)別控制系統(tǒng)（Artificial Neural NetworkPattern Recognition based Control, ANNPR-Ctrl）運(yùn)用于重組畢赤酵母的生長(zhǎng)階段，為高密度發(fā)酵的實(shí)現(xiàn)搭建了良好的通用平臺(tái)；對(duì)該菌株表達(dá)目標(biāo)蛋白時(shí)的最適甲醇濃度水平進(jìn)行了優(yōu)化（10g/L）；采用 20℃低溫誘導(dǎo)策略，使總蛋白產(chǎn)量提高 2~3 倍，最高 pIFN-α抗病毒活性提高近 10 倍，并探索了 20℃低溫誘導(dǎo)模式下碳代謝和能量代謝的變化情況，明確了低溫誘導(dǎo)可以提高能量（ATP）再生效率和發(fā)酵性能，在 20℃低溫，5L 罐下通入富氧空氣時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，使 DO 水平控制在≧50%的水平，其最高抗病毒活性可達(dá)3.6×107IU/mL，目標(biāo)蛋白產(chǎn)量可以達(dá)到 1.375g/L。在此基礎(chǔ)上，本人又進(jìn)一步嘗試了山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)這一發(fā)酵控制策略，研究結(jié)果顯示，共混流加誘導(dǎo)下的最高總蛋白濃度是 20℃低溫誘導(dǎo)的 3 倍，pIFN-α 抗病毒活性是 30℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下最高活性的100 倍以上。
雖然低溫（20℃）誘導(dǎo)可以改變甲醇代謝中的代謝流分布、加大蛋白合成支路的碳代謝通量、提高能量（ATP）再生效率和目標(biāo)蛋白的濃度。但是，由于此時(shí) ATP 的供給需求大幅增加、耗氧量激增，導(dǎo)致規(guī)模發(fā)酵（10-100L）下的操作成本（冷卻和供氧能耗）急劇上升。山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)可緩解甲醇作為唯一能源對(duì)細(xì)胞工作運(yùn)轉(zhuǎn)的供能壓力和目標(biāo)蛋白的降解，同時(shí)還對(duì)醇氧化酶 AOX 具有一定程度的可逆性抑制作用、可以對(duì)甲醇代謝速率進(jìn)行適度調(diào)控。理論上，這可以緩解低溫誘導(dǎo)條件下，溶氧需求過高、溫度和溶解氧濃度（DO）難以控制的問題。另外，山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)究竟是如何、通過何種途徑來提高目標(biāo)蛋白（pIFN-α）的濃度或活性的，其代謝和酶學(xué)機(jī)理尚不明確。
圍繞以上問題，在國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 973 計(jì)劃 (No.2007CB714306) 和上海市科學(xué)委員會(huì)農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)項(xiàng)目 (No.07391908) 的資助下，課題組以提高pIFN-α抗病毒活性、降低發(fā)酵成本為目標(biāo)，重點(diǎn)探討了 10L 罐下，山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)對(duì)畢赤酵母生產(chǎn)豬 α 干擾素產(chǎn)能途徑改變和發(fā)酵性能改善的影響，為 pIFN-α 的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考和借鑒。主要研究?jī)?nèi)容包括：
1） 在通用的高效發(fā)酵平臺(tái)下，通過多批 10L 罐下畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn) pIFN-α 的實(shí)驗(yàn)，研究 30℃/20℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)和 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 pIFN-α 發(fā)酵生產(chǎn)性能。采集發(fā)酵表觀參數(shù)碳源比消耗速率、耗氧速度（OUR）、CO2、釋放速度（CER）、呼吸商（RQ）等，檢測(cè)發(fā)酵結(jié)果目標(biāo)蛋白量、抗病毒活性，考察 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略在目標(biāo)蛋白產(chǎn)量、抗病毒活性、發(fā)酵工藝和發(fā)酵成本等多方面的優(yōu)勢(shì)。
2） 使用通用的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法檢測(cè)不同條件下畢赤酵母誘導(dǎo)期關(guān)鍵產(chǎn)能途徑的關(guān)鍵酶活性，通過該活性數(shù)據(jù)分析不同條件下畢赤酵母的主要供能途徑，得出 20℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)下的主要供能途徑為甲醛異化途徑，30℃、甲醇/山梨醇共混流加下主要供能途徑為TCA 循環(huán)，并重點(diǎn)分析后者在誘導(dǎo)期主要供能途徑如何由甲醛異化途徑轉(zhuǎn)向 TCA 循環(huán)。
3） 結(jié)合上述兩方面的數(shù)據(jù)構(gòu)建 30℃/20℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)和 30℃甲醇/山梨醇共混流加三種模式下的代謝模型，計(jì)算三種模式下的碳代謝流分配比、理論耗氧速率和能量效率，得到甲醇/山梨醇共混流加下走向 pIFN-α 蛋白合成的碳代謝流分配比例和能量效率明顯提高，理論耗氧速率明顯降低的結(jié)論。為 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略的高產(chǎn)提供了理論依據(jù)。
4） 通過檢測(cè)不同誘導(dǎo)策略下中間代謝毒副產(chǎn)物甲醛、甲酸的胞內(nèi)積累以及畢赤酵母產(chǎn)能途徑關(guān)鍵物質(zhì)濃度來驗(yàn)證產(chǎn)能途徑的變化。20℃甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)條件下甲醛異化途徑的副產(chǎn)物甲醛、甲酸和 30℃甲醇/山梨醇共混流加策略下的 TCA 前體和關(guān)鍵物質(zhì)濃度的積累量相對(duì)較高，分別對(duì)應(yīng)不同條件下相對(duì)活躍的供能途徑。
5） 研究了不同山梨醇流加速率對(duì)畢赤酵母代謝途徑的影響。證實(shí)了文中對(duì)最優(yōu)山梨醇流加速率的選擇。改變山梨醇流加速率會(huì)對(duì)畢赤酵母的代謝產(chǎn)能產(chǎn)生明顯的影響，應(yīng)該將山梨醇流加速率控制在最佳水平。
由于國(guó)內(nèi)外關(guān)于畢赤酵母代謝模型分析的文獻(xiàn)報(bào)道集中于常規(guī)發(fā)酵過程，極少有針對(duì)高效的誘導(dǎo)策略下發(fā)酵過程進(jìn)行代謝分析。因此此次研究將對(duì)不同誘導(dǎo)策略下的畢赤酵母發(fā)酵過程代謝分析方法的建立起到重要的參考意義。在發(fā)酵工藝方面，開展10 L罐規(guī)模下畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)pIFN-α酶學(xué)、碳代謝、能量代謝方面的系統(tǒng)研究，該研究的目是為形成高效和批量化的 pIFN-α發(fā)酵生產(chǎn)體系提供理論依據(jù)，并可為 pIFN-α 的商業(yè)生產(chǎn)提供一定的借鑒和參考。
