斷奶仔豬盡管處于高速生長的階段，但往往會因腸道功能發(fā)育不全和內(nèi)生態(tài)環(huán)境紊亂陷入亞健康危機[1]。仔豬腸道不僅具有消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能，作為分泌和免疫器官，還能將機體內(nèi)環(huán)境與細菌及毒素隔絕，因此腸道健康對仔豬健康養(yǎng)殖至關(guān)重要[2]。而斷奶應(yīng)激刺激腸道干細胞快速分化和增殖，以適應(yīng)斷奶引起的變化。然而，分化過程的加速可能導(dǎo)致未成熟腸上皮細胞和杯狀細胞比例的增加，主要表現(xiàn)為隱窩深度加深和腸絨毛高度降低，影響腸通透性，降低腸道對毒素和病原體的屏障功能[3]。飼料端禁抗之后，仔豬腸道病原微生物的失控促使疾病頻發(fā)、免疫應(yīng)激、屏障功能損傷等問題日益嚴(yán)峻，說明腸道發(fā)育的機制是調(diào)控腸上皮細胞發(fā)育的關(guān)鍵[4]。因此，文章系統(tǒng)綜述了豬腸道發(fā)育進程的最新研究方法，以期進一步推動無抗養(yǎng)殖技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，為我國生豬產(chǎn)業(yè)安全、高效、高質(zhì)量的健康發(fā)展提供參考。
1 豬腸道研究模型
傳統(tǒng)的腸道模型雖然可以在完整動物中或離體研究中進行評估，但成本高昂且勞動強度大。為了更高效研究豬腸道發(fā)育和營養(yǎng)調(diào)控，研究者通過培養(yǎng)細胞和類器官等方便、經(jīng)濟、易操作的體外模型闡明其作用機制[5]。
1.1 腸道上皮細胞
豬腸道是由從胃到肛門的連續(xù)消化道組成，其中腸壁由內(nèi)至外分別是黏膜層（上皮層）、黏膜下層、固有肌層和漿膜層。腸上皮由大量重復(fù)自我更新的隱窩-絨毛軸（crypt-villus axis, CVA）單位組成，其中絨毛延伸出腸腔，隱窩內(nèi)陷到下層間質(zhì)[6]。腸道上皮細胞（intestinal epithelial cells, IEC）分為吸收型細胞和分泌型細胞，包括腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、簇細胞、腸內(nèi)分泌細胞和微皺褶細胞等，具有營養(yǎng)消化吸收、屏障功能、免疫功能、生物節(jié)律等功能[7]。隱窩中有腸干細胞和轉(zhuǎn)運擴增細胞，隱窩底部的腸道干細胞（intestinal stem cells, ISC）嚴(yán)格調(diào)控著腸道的發(fā)育，IEC發(fā)育過程中，腸道由空泡狀胎兒型上皮細胞（形成球形胎兒型類器官）逐步分化為成年上皮細胞（形成花瓣狀成年型類器官）[8]。仔豬腸道上皮發(fā)育過程伴隨消化吸收方式的變化，空泡狀胎兒型干細胞內(nèi)含有大量溶酶體，通過胞吞作用吸收蛋白質(zhì)，通過空泡內(nèi)部溶酶體消化成小肽或氨基酸，從而實現(xiàn)細胞內(nèi)消化，而成年上皮細胞逐步向細胞外消化轉(zhuǎn)變，此時氨基酸轉(zhuǎn)運載體顯著高于胎兒型上皮細胞[9]。
IEC作為腸道免疫防御系統(tǒng)的第一道防線，在抵抗腸道病原菌感染過程中發(fā)揮了重要作用，營養(yǎng)感知信號與宿主防御功能在IEC中相互協(xié)調(diào)具有重要的生物學(xué)意義[10]。例如，斷奶仔豬IEC膜蛋白糖基化水平降低，腸道花生四烯酸、精氨酸和天冬氨酸等代謝通路的相關(guān)基因或蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化[11]。此外，隨著腸道隱窩-絨毛軸上皮細胞的分化成熟，負(fù)責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的蛋白質(zhì)在隱窩-絨毛軸上呈現(xiàn)獨特的表達模式，而細胞骨架等蛋白質(zhì)隨分化表達上調(diào)；mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達和細胞抗氧化能力表達下調(diào)[12]。
1.2 腸道類器官
傳統(tǒng)消化道模型存在難以滿足豬精準(zhǔn)營養(yǎng)需求研究；而動物模型具有可操作性差、重復(fù)性低、菌群易感性高的局限性；腸道細胞系可用的不多，無法重現(xiàn)隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)，因此類器官是體外模擬腸道上皮結(jié)構(gòu)和功能的最佳模型。腸道類器官（intestinal organoid, IO），又稱迷你腸（mini-gut），是由離體的ISC和隱窩在適量的生長因子介導(dǎo)下，在基質(zhì)膠中經(jīng)由3D培養(yǎng)模式形成具有完整腸道組織的結(jié)構(gòu)，近年來被用作腸道上皮細胞更新和發(fā)育及調(diào)控的體外模型[13]。研究發(fā)現(xiàn)，這些IO含有所有種類的腸上皮功能細胞，包括腸上皮細胞、腸內(nèi)分泌細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和Lgr5+干細胞。IO含有多個隱窩結(jié)構(gòu)，并相互連接形成中間有腸腔的迷你腸。豬IO體外模型的建立突破從以往研究中僅能觀察表型的局限性，拓展到功能細胞單位層次，為更好地揭示環(huán)境因子與豬腸道互作機制奠定了基礎(chǔ)[14]。
迷你腸研究的新方法包括腸道芯片和懸滴培養(yǎng)體系。通過“單腸道類器官微流控芯片”可為IO單顆粒實時示蹤提供穩(wěn)定平臺，實現(xiàn)高通量篩選能促進腸道上皮細胞發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)[15]。該芯片采用截面型微流控芯片模具設(shè)計，在上皮通道之上和血管通道之下含有多孔柔性聚二甲基硅氧烷薄膜，通過精準(zhǔn)進樣及液體循環(huán)控制模塊、片上實時電化學(xué)監(jiān)測模塊和熒光標(biāo)志粉實時圖像捕捉模塊對單病毒實時示蹤和腸道屏障功能實時監(jiān)測[16]。在懸滴培養(yǎng)體系中，將IO重懸于特質(zhì)的培養(yǎng)基中，然后將細胞懸液分裝于96孔Perfecta 3D懸滴板中培養(yǎng)。懸滴系統(tǒng)需要的培養(yǎng)基更少，具有更快的細胞接種過程，同時規(guī)避不同批次培養(yǎng)基的異質(zhì)性所造成的實驗誤差[17]。
2 豬腸道研究技術(shù)
研究腸道發(fā)育和健康的主要技術(shù)手段主要包括生化分析及技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)、細胞培養(yǎng)（細胞系、原代、類器官等）、同位素標(biāo)記及高通量組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組學(xué)、單細胞測序等）、生物信息學(xué)關(guān)聯(lián)分析等[18]。
2.1 生化分析及分子生物學(xué)技術(shù)
生化分析及分子生物學(xué)技術(shù)是腸道上皮細胞研究的基本技術(shù)手段，常用的包括生理生化指標(biāo)檢測、凝膠電泳分子雜交、PCR技術(shù)、DNA物理圖譜、DNA序列測定以及基因芯片、基因敲除等。例如，在百草枯誘導(dǎo)的腸道氧化應(yīng)激體內(nèi)外模型中，抑制敲除腸髓樣分化因子88（MyD88）基因可緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腸上皮細胞的細胞凋亡、周期阻滯、DNA損傷和線粒體功能障礙，其機制是通過調(diào)控mTOR-p53通路促進自噬，進而減少活性氧的積累。該研究廣泛應(yīng)用現(xiàn)代生化分析及分子生物學(xué)技術(shù)，揭示了MyD88調(diào)節(jié)腸道氧化應(yīng)激的重要作用，為營養(yǎng)調(diào)控仔豬腸道氧化損傷提供了潛在靶點[19]。
2.2 高通量組學(xué)
IEC增殖、分化和凋亡在腸道發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，這種協(xié)調(diào)需要大量而即時的信號通路的干預(yù)，IEC增殖與凋亡平衡的紊亂可能導(dǎo)致各類腸道疾病產(chǎn)生[20]。miRNAs在腸道上皮的生長性能，腸道形態(tài)，營養(yǎng)吸收和屏障功能中起著至關(guān)重要的作用，如miRNA-29，它靶向NF-κB抑制因子和claudin 1，以增加腸通透性[21]。為了鑒定調(diào)控IEC更新的miRNAs，Zou等[22]對絨毛上細胞（F1）和隱窩細胞（F3）進行了高通量測序，結(jié)果表明miRNA-100可促進豬腸上皮細胞的分化和凋亡，抑制腸上皮細胞的增殖和遷移。
2.3 生物信息學(xué)關(guān)聯(lián)分析
腸道微生物組是一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，不僅影響日糧的消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其活動和相互關(guān)系對仔豬腸道健康至關(guān)重要。仔豬斷奶應(yīng)激往往導(dǎo)致腸道菌群紊亂，使得免疫功能缺失和疾病易感性進一步增加[23]。Bai等[24]基于Miseq測序僅在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.2%~0.8%的牡丹皮可改善斷奶仔豬腸道菌群，包括提高微生物豐富度，增加厚壁菌門和乳酸菌屬的豐度，這些菌屬可能與提高營養(yǎng)吸收水平和腸黏膜免疫相關(guān)；以及降低擬桿菌屬和腸球菌屬的豐度，這些菌屬可能與潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)直腸癌等胃腸疾病相關(guān)。
3 豬腸道發(fā)育影響因素
3.1 遺傳因素
遺傳因素是影響豬腸道發(fā)育的主要因素，闡明其機制和規(guī)律是尋求調(diào)控手段的先決條件。豬小腸長度與平均日增重及平均日采食量顯著正相關(guān)，因此可以通過調(diào)控仔豬ISC增加仔豬小腸長度來改善生長性能[25]。地方豬和外來豬腸道上皮發(fā)育往往存在顯著差異。大白豬在小腸長度和小腸長度指數(shù)（長度/體重）顯著高于地方豬種沙子嶺豬，但是沙子嶺豬在絨毛高度和黏膜消化酶活性及轉(zhuǎn)運載體表達上顯著高于大白豬，可能地方豬和外來豬在腸道營養(yǎng)消化吸收上采取了不同的適應(yīng)機制[26]。盡管小腸長度是一個高營養(yǎng)代謝器官，隨著長度的增加，其營養(yǎng)消耗也增加，但是總體上調(diào)控腸道發(fā)育還是可以改善日增重和采食量。
3.2 代謝因素
由于門靜脈引流的內(nèi)臟（腸、胰腺、脾和胃）僅占體重的5%，卻占全身能量消耗的約30%，并且腸道的能量利用率較高，故了解哺乳期間IEC能量代謝變化對調(diào)控新生仔豬腸黏膜發(fā)育具有重要意義[27]。細胞分化過程中，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收相關(guān)蛋白質(zhì)的表達上調(diào)；結(jié)構(gòu)和酶調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)，從7、14、21日齡仔豬空腸中段分離出隱窩細胞，利用同位素標(biāo)記進行相對和絕對定量分析蛋白質(zhì)合成，結(jié)果表明哺乳期仔豬腸道隱窩上皮細胞的能量代謝發(fā)生了變化，這種代謝模式因葡萄糖、脂肪酸和氨基酸（涉及糖酵解和檸檬酸循環(huán)代謝相關(guān)蛋白的產(chǎn)量）而異[28]。此外，斷奶仔豬對飼糧粗蛋白（CP）水平極為敏感，腸道中消化不良的高水平CP會促進致病菌的產(chǎn)生，增加消化系統(tǒng)疾病的風(fēng)險，低蛋白日糧添加維生素B6可能通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝影響腸道健康[29]。
3.3 應(yīng)激因素
腸上皮依賴于復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物在不同的細胞間連接成屏障，腸黏膜的修復(fù)是上皮完整性和連續(xù)性的快速重建，包括鄰近損傷表面的上皮細胞遷移到損傷表面。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黏膜細胞有效能量的供應(yīng)不足，不能維持正常的更新及損傷修復(fù)，從而抑制仔豬生長潛力的完全發(fā)揮[30]。哺乳期仔豬小腸細胞增殖、AKP活性和細胞間連接蛋白表達量隨日齡逐漸增加。斷奶14日齡血漿D-乳酸含量和小腸Kv通道表達增加，絨毛高度/隱窩深度、細胞增殖、AKP活性和小腸細胞間連接蛋白表達降低。黏膜細胞增殖分化從出生至21日齡逐漸升高；早期斷奶后黏膜損傷在第3天至第5天最為嚴(yán)重，隨后逐漸恢復(fù)[31]。細胞自噬是細胞反應(yīng)中氧化還原信號的一個主要傳感器，在緩解機體氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧（ROS）能通過自噬形成過程中的各種通路誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。研究表明，嘔吐毒素（DON）誘導(dǎo)自噬缺失細胞ROS水平升高，導(dǎo)致細胞死亡，ER折疊蛋白表達降低導(dǎo)致細胞應(yīng)激反應(yīng)失敗。自噬通過IKK通路緩解氧化應(yīng)激保護腸上皮細胞免受嘔吐毒素DON的毒害作用，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除豬腸上皮細胞中的Atg5（誘導(dǎo)自噬缺失），DON誘導(dǎo)正常細胞自噬，不會誘導(dǎo)Atg5-/-細胞自噬[32]。
4 豬腸道發(fā)育營養(yǎng)調(diào)控
早期斷奶時腸道適應(yīng)期所進行的各種適應(yīng)性改變的最終結(jié)果就是腸道成熟。腸道成熟的實質(zhì)是腸道重建，即由新分化的具有成熟功能的腸細胞逐步替代原有腸細胞的過程。小腸的功能單位是絨毛，小腸絨毛結(jié)構(gòu)的變化的根本原因是黏膜細胞的有效能量的供給不足，必然導(dǎo)致腸細胞內(nèi)源性“饑餓”，細胞不能獲得進行多種生理活動所需的能量，導(dǎo)致小腸黏膜的形態(tài)、結(jié)構(gòu)異常，絨毛變短，隱窩變深[33]。我們通過營養(yǎng)手段來調(diào)節(jié)斷奶應(yīng)激造成的腸道損傷。包括從營養(yǎng)水平、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控（DNA甲基化、染色質(zhì)開放型、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子）、微生物菌群-上皮細胞-免疫細胞互作等方面干預(yù)腸上皮細胞更新機制和腸道營養(yǎng)素吸收代謝規(guī)律，從而實現(xiàn)仔豬腸道健康和生長性能提升。
氨基酸而非血糖是小腸黏膜的主要能量來源，腸道細胞利用谷氨酰胺的基礎(chǔ)代謝和ATP生成均高于葡萄糖，驗證了腸上皮細胞優(yōu)先利用谷氨酰胺作為能量來源的結(jié)論。Qi等[34]發(fā)現(xiàn)在正常能量供應(yīng)下，谷氨酰胺、谷氨酸和Asp可以通過補充Krebs循環(huán)恢復(fù)小腸能量穩(wěn)態(tài)，下調(diào)AMPK通路。然而,當(dāng)仔豬處于低能量供應(yīng)下，Gln、Glu和Asp不足以維持腸道能量平衡，此時機體會激活A(yù)MPK信號通路、脂肪酸的beta氧化及線粒體生物合成途徑以滿足仔豬腸上皮細胞的高能量需求，維持腸道黏膜能量穩(wěn)態(tài)。
多胺作為腸道的“成熟因子”，在幼齡動物的消化生理、營養(yǎng)代謝以及正常生長中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[35]。但是在新生仔豬腸道中，精氨酸酶活性很低，而脯氨酸氧化酶活性極高，所以在新生仔豬腸道中多胺的合成并不以精氨酸為主，而以脯氨酸為主。哺乳期仔豬灌喂腐胺及脯氨酸顯著提高了斷奶仔豬空腸PCNA陽性細胞率，有效地增加了空腸隱窩細胞的增殖能力；并且，脯氨酸提高了空腸堿性磷酸酶活性，促進了空腸細胞的分化[36]。維生素A（VA）通過影響仔豬ISC干預(yù)腸道發(fā)育和消化吸收功能，進而調(diào)控仔豬生長性能。與對照組相比，仔豬平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率在第8~14天顯著增加，這可能與腸道分化相關(guān)的Lgr5+基因豐度顯著升高有關(guān)[37]。
日糧中鐵營養(yǎng)影響杯狀細胞的分化和功能，缺鐵顯著抑制仔豬腸道上皮發(fā)育成熟。中/高濃度鐵狀態(tài)下的結(jié)腸杯狀細胞數(shù)量顯著高于低鐵狀態(tài)。缺鐵抑制仔豬腸道上皮發(fā)育主要表現(xiàn)為腸道器官指數(shù)（長度和重量）和形態(tài)結(jié)構(gòu)（絨毛高度和隱窩深度、絨毛表面積）顯著降低；空泡狀胎兒型上皮細胞增多，成年型上皮細胞標(biāo)志基因表達降低[38]。而甘氨酸螯合鐵（FebisGly）通過調(diào)控APMK/FOXO通路提高腸道抗氧化能力，增加仔豬腸道GSH水平，降低腸道MDA水平，通過增加結(jié)腸厚壁菌屬豐度、降低梭菌屬豐度，影響腸道次級膽汁酸組成和代謝[39]。相似地，銅（Cu）是動物生長所必需的微量元素，斷奶期飼糧中添加硫酸銅（CuSO4）改善了育肥豬的腸道形態(tài)，這可能是通過促進細胞增殖和提高ISC活性來實現(xiàn)的[40]。
自噬通過分解代謝回收細胞成分和受損的細胞器，以應(yīng)對營養(yǎng)剝奪、病毒感染和基因毒性應(yīng)激等逆境，自噬修飾劑常用于體內(nèi)外調(diào)控這一過程[41]。Nalbandian等[41]發(fā)現(xiàn)在仔豬斷奶的背景下，自噬修飾劑氯喹（CQ）和雷帕霉素（RAPA）呈現(xiàn)出不同的效果，前者CQ通過在溶酶體中酸化和干擾液泡H+ATP酶來逆轉(zhuǎn)自噬，灌服CQ后能部分抑制腸道細胞自噬，緩解仔豬斷奶過程的生長抑制作用以及改善腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，而后者RAPA是mTOR信號通路機制靶點的特異性抑制劑，則加劇了斷奶引起的腸黏膜形態(tài)損傷。
以植物提取物為主的天然產(chǎn)物是保持腸道健康的新趨勢。鞣花酸（EA）是分布于石榴等眾多水果或堅果中的天然多酚類抗氧化劑。EA緩解了氧化應(yīng)激引起的斷奶仔豬生長停滯，激活氧化應(yīng)激仔豬腸道Nrf2信號通路來改善黏膜屏障功能和提高緊密連接蛋白的表達，從而促進仔豬腸道溶酶菌和免疫球蛋白A的分泌[42]。在與之相關(guān)的試驗中，50 mg/kg和100 mg/kg EA顯著提高了百草枯染毒過程中與Nrf2/Keap1信號通路激活相關(guān)的抗氧化酶的活性，并且增加盲腸L. amylovorus和L. reuteri的相對豐度，有效地改善了百草枯誘導(dǎo)的肝臟氧化和炎癥損傷，重塑腸道微生物結(jié)構(gòu)與多樣性[43]。微囊植物精油、普通精油、金霉素對斷奶仔豬盲腸、結(jié)腸微生物β多樣性的影響。低劑量微囊精油（100 mg/kg）可顯著降低盲腸和結(jié)腸中潛在致病菌/有益菌的比值，效果優(yōu)于普通精油?？股貢呓Y(jié)腸潛在致病菌/有益菌的比值。
5 小結(jié)
腸道是最重要的營養(yǎng)吸收和代謝場所，只有保證腸道的健康發(fā)育，才能保證畜牧產(chǎn)業(yè)的平穩(wěn)可持續(xù)良性發(fā)展，為我國的助農(nóng)富農(nóng)推進鄉(xiāng)村振興添磚加瓦。本文綜述了近幾年仔豬腸道發(fā)育與營養(yǎng)調(diào)控應(yīng)用的研究進展，從基因、蛋白質(zhì)和代謝物層面系統(tǒng)揭示了斷奶仔豬腸上皮細胞隱窩-絨毛軸結(jié)構(gòu)發(fā)育和分化特性以及斷奶后腸道的適應(yīng)性變化規(guī)律，闡明了眾多替抗產(chǎn)品等對斷奶仔豬生長性能和腸道健康的影響和作用機制。
參考文獻及更多內(nèi)容詳見：
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