本標準規(guī)定了牛脂肪組織中馬波沙星殘留量檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS）測定方法。
本標準適用于牛脂肪組織中馬波沙星殘留的定性和定量測定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。
GB/T 6379 測試方法的精密度 通過實驗室間試驗確定標準測試方法的重復性和再現(xiàn)性
GB/T 1.1-2009 標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法
3 制樣
3.1 樣品的制備
取新鮮或解凍的空白或供試動物組織，剪碎，并使均質。
3.2 樣品的保存
-20℃以下保存。
4 測定方法
4.1 方法提要或原理
牛脂肪中殘留的馬波沙星用5%三氯乙酸溶液（TCA）和含1%乙酸的乙腈溶液提?。╒/V=8∶2），正己烷除脂，以馬波沙星-D8為內標，用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，內標法定量。
4.2 試劑和材料
以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。
4.2.1 馬波沙星對照品：含量≥98.0%。
4.2.2 馬波沙星-D8對照品：含量≥98%。
4.2.3 甲醇：色譜純。
4.2.4 甲酸銨：色譜純。
4.2.5 甲酸：色譜純。
4.2.6 乙酸。
4.2.7 三氯乙酸（TCA）。
4.2.8 二甲基亞砜。
4.2.9 正己烷。
4.2.10 1mol/L甲酸銨溶液
稱取3.15g甲酸銨，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。
4.2.11 5%三氯乙酸（TCA）
稱取50.0g三氯乙酸，置1000ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。
4.2.12 含1%乙酸的乙腈溶液
量取500ml乙腈和10ml乙酸，置1000ml容量瓶中，混勻，用乙腈稀釋至刻度。
4.2.13 馬波沙星標準儲備液（1000μg/ml）
取馬波沙星對照品約10mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，用二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，配制成為濃度為1000μg/ml的馬波沙星標準儲備液。－18 ℃以下保存，有效期6個月。
4.2.14 馬波沙星-D8內標儲備液（100μg/ml）
取馬波沙星-D8對照品0.5mg，精密稱定，置5ml容量瓶中，用二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100μg /ml的馬波沙星-D8內標儲備液。－18 ℃以下保存，有效期6個月。
4.2.15 馬波沙星標準工作液（2μg/ml）
精密量取馬波沙星標準儲備液適量，用乙腈稀釋成濃度為2μg/ml的標準工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
4.2.16 馬波沙星-D8內標工作液（1.2μg/ml）
精密量取馬波沙星-D8內標儲備液適量，用乙腈稀釋成濃度為1.2μg/ml的內標工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
4.3 儀器和設備
4.3.1 液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配有電噴霧離子源。
4.3.2 分析天平：感量0.00001g；感量0.0001g。
4.3.3 天平：感量0.01g。
4.3.4 勻漿機。
4.3.5 離心機。
4.3.6 渦旋混合器。
4.3.7 離心管：50ml。
4.3.8 試管：10ml。
4.3.9 棕色容量瓶：5ml，50ml，100 ml。
4.3.10濾膜：0.22μm。
4.4 測定步驟
4.4.1試樣的制備
取新鮮或冷凍空白或供試組織，剪碎，并使均質。
——取均質后的供試樣品，作為供試試樣。
——取均質后的空白樣品，作為空白試樣。
——取均質后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試樣。
4.4.2試樣保存
－20℃以下保存。
4.4.3 提取
稱取試樣（2 ± 0.01）g，置50 ml離心管中，添加1.2μg/ml馬波沙星-D8內標工作液適量，加5%TCA溶液和含1%乙酸的乙腈溶液（V/V=8∶2）5ml，振蕩5min， 10000r/min 離心10min，取上清液1.5ml于10ml試管中，加正己烷2ml，渦旋1min，靜置5min，取下層清液1ml，濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質譜分析測定。
4.4.4 標準曲線的制備
精密量取2μg/ml馬波沙星標準工作液和1.2μg/ml馬波沙星-D8內標工作液適量，用空白脂肪提取液稀釋，配制成馬波沙星-D8濃度均為120ng/ml以及馬波沙星濃度為6、10、20、80、160、200、340和400ng/ml的系列標準工作液，供液相色譜-串聯(lián)質譜分析測定。以馬波沙星特征離子質量色譜峰面積與內標物峰面積比值為縱坐標，以馬波沙星濃度為橫坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程和相關系數(shù)。
4.4.5 測定
4.4.5.1 液相色譜條件
色譜柱：C18 柱 （2.0 mm×150 mm，粒徑5μm）， 或效能相當者；
流動相：流動相A為1000ml水+1ml甲酸+500μl 1mol/L甲酸銨溶液；流動相B為1000ml甲醇+1ml甲酸+500μl 1mol/L甲酸銨溶液，梯度洗脫條件參見表2；
流速：0.25 ml/min；
柱溫：30℃；
進樣量：5μl。
離子源：電噴霧離子源；
掃描方式：正離子掃描；
檢測方式：多反應監(jiān)測；
氣體溫度：350℃；
輔助氣：N2；
輔助氣流速：9.0L/min。
目標化合物定性、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量見表3。
4.4.5.3.1 定性測定
通過試樣色譜圖的保留時間與相應標準溶液的保留時間、各色譜峰的特征離子與相應濃度標準溶液各色譜峰的特征離子相對照定性。試樣與標準溶液保留時間的相對偏差不大于5%；試樣特征離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表4的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應的被測物。
取試樣溶液和標準溶液，做單點或多點校準。按內標法以峰面積比定量。標準溶液及試樣溶液中的馬波沙星響應值均在儀器檢測的線性范圍內。在上述色譜-質譜條件下，馬波沙星標準溶液和空白添加試樣溶液中特征離子質量色譜圖見附錄A。
4.4.6 空白實驗
除不加試樣外，采用完全相同的步驟進行平行操作。
4.5 結果計算和表述
4.5.1 單點校正法
X為試樣中馬波沙星的殘留量（μg/kg）；
A為試樣溶液中馬波沙星峰面積；
As為標準溶液中馬波沙星峰面積；
A1內為試樣溶液中內標物峰面積；
A2內為標準溶液中內標物峰面積；
Cs為標準溶液中馬波沙星濃度（ng/ml）；
V為試樣最終定容體積（ml）；
m為試樣的質量（g）。
注：計算結果需要扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。
4.5.2 多點校正法
X為試樣中馬波沙星的殘留量（μg/kg）；
C為根據(jù)標準曲線計算得到的試樣中馬波沙星的濃度（ng/ml）；
V為試樣最終定容體積（ml）；
m為試樣質量（g）。
注：計算結果需要扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。
5 方法靈敏度、準確度和精密度
5.1 靈敏度
本方法檢出限為7.5μg/kg，定量限為25μg/kg。
5.2 準確度
本方法在25μg/kg～100 μg/kg添加濃度水平上的回收率為80%～120%。
5.3 精密度
本方法的批內相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。
